由CAR-T为代表的免疫细胞疗法，为人类抗肿瘤药物事业添了浓墨重彩的一笔。但不得不说的是，免疫细胞疗法的可及性看起来并不高，诺华的Kymriah定价47.5万美元，吉利德kite的Yescarta定价37.3万美元，国内复星凯特的阿基伦赛注射液定价也高达120万人民币。时至今日，CAR-T疗法这只王谢堂前燕，看起来仍然很难飞入寻常百姓家。上述CAR-T细胞疗法的高昂定价，源于其不得不采用“私人订制”的方式来制备药物。于是不少研发者开始将目光转向通用型的细胞疗法，通过大规模制备的方式，使得成本大幅降低，从而降低用药价格。

通用型，off the shelf，是细胞疗法领域中被大家提及最多的关键词，指的是同种异体细胞疗法，即无需从患者自身体内分离免疫细胞，而是利用异体的免疫细胞，通过一定的改造及培养，再回输到患者体内（这里的通用型仅讨论通用型“T”，其他通用型“CAR”概念，比如亮氨酸适配体拉链CAR，与生物素结合免疫受体CAR，不在此讨论）。这一系列流程中技术玄机不少，在搞清楚前，让我们先来看看为什么普通的CAR-T细胞疗法必须要采用自体的方式。

若异体CAR-T细胞直接输入到患者体内会发生两个事件，（1）患者机体本身的免疫系统将异体CAR-T细胞识别为外来物，消灭异体的CAR-T细胞，也就是排异反应（也称宿主抗移植物反应，HVGR）；（2）异体的CAR-T细胞将整个患者视为“非我”，从而疯狂攻击患者的各个组织器官，也就是移植物抗宿主病（GvHD）。前者会使得CAR-T药物失去治疗效果，后者则有可能危及患者生命。那么为什么会发生上述两个事件呢，这与细胞的识别机制相关。脊椎动物基因组中有一类家族为主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC），在人类中MHC又称人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）。编码HLA的基因位于第6号染色体，分为三大类基因区，其转录翻译而成的蛋白质就是位于细胞表面的HLA抗原，HLA抗原是免疫细胞识别“自我”与“非我”的重要标志。所以说当进入人体的T细胞表面HLA配型和患者的免疫细胞表面HLA配型不一致时，就会发生上述的HVGR和GvHD。那么或许就有热心的朋友问了，HLA的基因座看起来并没有那么多，这世界上的人是否就可以分为多个群体，每个群体中的人HLA配型都一样，那么互相之间就可以异体T细胞回输了？想法很好，可是现实并非如此，事实上除了同卵双胞胎之外，世界上很难出现HLA完全相同的两个人。因为HLA复合体是人体基因多态性最丰富的系统，仅HLA-A这一个位点就有2000+种基因数，各个位点排列组合下来就是天文数字，这点在器官移植配型上体现的淋漓尽致。

大丈夫能屈能伸，既然正面刚不过，那就曲线救国，于是UCAR-T便应运而生。UCAR-T全称为Universal CAR-T，即通用型CAR-T。UCAR-T本质上是一种同种异体CAR-T细胞疗法，无需从患者体内分离T细胞，而是利用健康志愿者捐献T细胞，通过基因编辑技术，让其能够避免HVGR，同时避免GvHD，这当中十八般武艺各不相同，让我们一一了解。

解决GvHD

避免GvHD，其重要性不言而喻，其发生会对患者的组织器官造成强烈攻击，用药无效不要紧，倘若对患者会造成巨大损伤那就万分凶险了。因此研究者们首先想要解决的就是GvHD的问题。GvHD触发事件就是回输的T细胞表面TCR识别并结合了宿主器官细胞表面的HLA分子，并且这个回输T细胞发现，二者并不“契合”，于是开始发动攻击，造成GvHD。相对来说，解决GvHD并不难，目前有几种技术流派：

1 直接把TCR敲掉

克服GvHD最简单的方法，只要把回输T细胞的DNA中，表达TCR受体的基因敲除掉就可以。具体来说主要就是敲除TCRα亚基或β亚基的表达基因，实现手段就是几种常用的基因编辑方式，如ZFN、TALEN和CRISPR等。目前主流的UCAR-T都会做敲除TCR，当然也有一些该方法的变种，比如Celyad公司靶向NKG2DL的UCAR-T产品CYAD-101，并没有敲除TCR，而是在CAR之外，还转了表达TCR抑制性分子（TCR Inhibitory Molecule, TIM）进去，TIM的表达通过干扰CD3ζ的表达来减少TCR的形成，从而抑制了TCR的识别作用，这和敲除TCR有异曲同工之妙。当然，这里面的CAR设计也需要稍有不同，胞内信号区不能再使用CD3ζ了，而是需要改为使用CD3γ和CD3ε。CYAD-101的适应症是复发/难治性转移性结直肠癌，目前处于临床1期，预计今年下半年会报道临床数据。

图片来源：Celyad公司官网

2 用其他细胞类型来代替

这里的“其他细胞类型”，主要有NK细胞与γδT细胞。先说NK细胞，NK细胞（natural killer cell）也叫自然杀伤细胞，能通过（a）释放穿孔素、颗粒酶，（b）表达CD95配体和TRAIL从而诱导靶细胞凋亡，（c）细胞因子介导杀伤，（d）ADCC等方式直接杀死目标细胞。为什么它能避免GvHD，就是因为NK细胞表面是不表达或极低表达TCR的（NKT细胞除外），它对细胞的杀伤不依赖于TCR，不会引起GvHD，是通用细胞疗法的好帮手，现在也有不少公司在做CAR-NK，并且取得一定成绩，但CAR-NK仍然存在诸多问题，比如有效性不够持久，CAR的设计更加困难，CMC较难等，这里不再赘述。除了NK细胞之外，γδT细胞也逐渐走上舞台。γδT细胞也是T细胞的亚型，其主要作用就是细胞毒性杀伤。γδT细胞并非不表达TCR，而是其表达的TCR不像常规T细胞一样由αβ亚基组成，而是由γδ亚基组成。γδT细胞本身就具有杀伤肿瘤作用，但是其对肿瘤细胞的识别并不依赖于TCR与MHC-1的结合（这也是为什么γδT细胞能用来避免GvHD），而是依赖于其细胞表面的独特受体NCR与肿瘤细胞表面的压力配体结合。现如今有不少公司在开发基于γδT细胞的肿瘤免疫疗法，包括直接用CAR-γδT，或开发相应双抗等等。此外还有Atara公司做的EBV T细胞，能用来治疗EBV相关疾病（安上CAR之后亦可扩发适应症范围）。但上述不敲TCR的方法，并未完全解决GvHD。关于NK、γδT、EBV T等细胞疗法，有兴趣的看官也可关注后续系列文章。

解决HVGR

解决了GvHD之后，下一个难啃的硬骨头就是HVGR了，这也是各个UCAR-T公司真正凸显实力的时候。HVGR就是患者的免疫细胞对输入体内的细胞发动攻击，这里面主要的“攻击者”有两类，即患者的T细胞，与患者的NK细胞。患者T细胞上的TCR识别并结合了回输T细胞表面的HLA，并且发现二者不“契合”，于是发动攻击。那么又有热心的朋友想问了，我把回输T细胞表面的HLA全部敲除行不行？答案是否定的，因为还有NK细胞的存在。NK细胞是体内的重要杀伤细胞，是没有特异选择性的，NK可以理解为一个“佩刀武士”，并且这名佩刀武士是“见人就砍，毫不留情”，能让他区分敌人友军的方式，就是目标细胞表面有没有表达一些抑制性分子（比如HLA-1类分子），如果一个细胞上有表达HLA-1类分子，那就会被NK识别为友军不予杀伤；倘若一个细胞上不表达HLA-1类分子，那就会被NK识别为敌人，进行杀伤（NK细胞的这一作用机制若要深究的话，是因为其表面会表达一些抑制性受体，而HLA-1类分子就是这些受体的配体，若二者结合则相安无事，否则就会触发NK细胞的missing self假说，产生杀伤）。因此，想通过敲除回输T细胞表面的HLA是行不通的（CD8+T细胞主要表达HLA-1类分子，较少表达HLA-2类分子）。回输的异体T细胞，不敲HLA是死路一条，敲了HLA还是死路一条，可谓困难重重，所以说解决HVGR就是UCAR-T公司的核心能力所在，目前也已经衍生出多种流派：

1 只敲TCR，不敲HLA，但配合清淋

图片来源：Cellectis公司官网

清淋就是化疗清除淋巴细胞，在自体CAR-T治疗之前常需要清淋，即在回输前5-10天开始给予患者一定剂量的氟达拉滨和环磷酰胺，回输前1-2天结束。目的是降低肿瘤负荷，并且给CAR-T细胞更多的增殖空间。UCAR-T的第一种技术路径也一定要伴随着清淋，因为这类UCAR-T并没有敲除HLA，因此必须先将人体的淋巴细胞压制在较低水平一段时间，在这段时间内患者的淋巴细胞较少，不足以对回输的异源T细胞产生足够强度的排异反应，故而回输的UCAR-T方能够得到扩增时机，并且在这段时间内发挥药效。这里就不得不提该领域的重要先驱法国Cellectis（NASDAQ:CLLS），公司的多款UCAR-T都采用TALEN基因编辑的方式，敲除TCRα的方式来克服GvHD，此外并没有敲除HLA，而是敲除了CD52，在回输之前的清淋采用氟达拉滨+环磷酰胺+阿伦珠单抗的化疗组合。其原因为：氟达拉滨+环磷酰胺这一普通清淋方式，所能维持的这段低淋巴细胞时期较短，大约1-2周左右，在这段时间内异源T细胞能够获得增殖机会，可一旦这一时间窗口过去，宿主免疫能力回升，则异源的UCAR-T细胞由于机体排异反应开始死亡，目前主流CAR-T在体内存活的中位数大概为3-4周。Cellectis希望延长这段低淋巴细胞时间窗口，从而让UCAR-T能在更长的时间内发挥疗效，因此给与靶向CD52的阿伦珠单抗，而CD52广泛表达于各种免疫细胞表面，阿伦珠单抗能够通过ADCC的方式杀死这些免疫细胞，也就是进一步加深了清淋的效果，使得UCAR-T的可作用时间窗口进一步延长。而敲掉回输T细胞上的CD52，就是避免阿伦珠单抗杀死回输的T细胞。在2015年，Cellectis的UCAR-T成功挽救了一名1岁大的AML婴儿患者，风光一时无两。不过Cellectis在2017年时由于UCART123导致一例患者死亡而被叫停，并于数月后修改临床方案后重新启动研究。2020年7月Cellectis的UCARCS1A又因为一名患者死亡而被叫停，这也一度使市场对UCAR-T赛道失去信心。Cellectis相关患者死亡案例的原因有多种猜测，可能是因为回输剂量过高，也有可能是制备的UCAR-T的脱靶率较高。当然这并非说明该技术路径走不通，国内外亦有部分企业采取该种技术路径，并做了系统性优化，仍然值得期待。这种路子说白了就是免疫抑制，所以需要引起注意的是，清淋压制了免疫系统之后对容易引起患者感染的风险。

2 敲TCR，同时敲B2M

HLA-1类分子的结构大致由两部分组成，即α链（由α1、2、3组成）和β链，β链是非MHC分子β2微球蛋白（B2M），其编码基因位于人体15号染色体上。HLA-1类分子的形成依赖由α链和β链形成异源二聚体，当敲除B2M对应的基因后，B2M无法转录翻译出来，α链也就无法和β链形成二聚，因此细胞膜上α链也没法单独稳定存在，这就意味着细胞膜上不会存在HLA-1类分子，即：敲了B2M就意味着敲了整个HLA-1。瑞士公司CRISPR Therapeutics（NASDAQ:CRSP）就是采用了这样的技术路径，通过CRISPR同时敲除TCR和B2M。敲了B2M可以完美逃过宿主T细胞的攻击，但是如前所述，缺乏HLA-1的细胞会被NK细胞识别并杀死，所以若要取得良好的效果，则需要在清淋上下更多的功夫。CRISPR设计了独特的清淋方案，也取得了不错的临床效果，但依然要警惕可能带来的感染风险。

图片来源：CRISPR Therapeutics公司招股书

3 敲TCR，敲HLA-1，同时转入抑制性基因

随着越来越多HLA-1敲除的产品得到研发，缺失HLA-1分子的UCAR-T细胞容易被NK细胞杀死这件事，得到了更加充分的认知。看NK的名字就知道它是个狠人，这个“佩刀武士” 砍起人来，连它自己都怕，于是不少研发者将目光聚焦于再转一个抑制性基因进UCAR-T细胞，从而表达出抑制性的配体分子，让回输的UCAR-T被NK识别为“友军”，从而避免被NK细胞杀死。那么转什么样的抑制性基因合适呢？这里就需要先研究一下NK细胞表面的受体类型了，NK细胞表面的受体大致可分为两类，一类是激动性受体（NK细胞的油门），一类是抑制性受体（NK细胞的刹车），因此理论上讲，只要给UCAR-T细胞基因组里导入抑制性受体的配体，就能够避免被NK细胞杀死。比如非经典的HLA分子，起到替代HLA-1的作用，这里常用的有导入HLA-E（与NKG2A/CD94复合物结合）、HLA-G（与KIR2DL4结合）、siglect 7、siglect 9等。但是这种方式仍然存在局限性，比如最常导入的HLA-E的策略，这种方式只能够阻止NK细胞的亚群---NKG2A阳性NK的攻击，但是对其他NK亚群（例如KIR2DL1-4阳性的NK细胞）的攻击就不能阻止了，因为KIR2DL1-4阳性NK细胞需要通过HLA-C或HLA-G才能阻止。

图片来源：Cell Death & Differentiation volume 21, pages5–14 (2014)

4 敲TCR，同时把防御机制工程化到T细胞上

图片来源：Nature Biotechnology volume 39, pages 56–63 (2021)

图片来源：亘喜公司官网

这种流派发现及应用时间尚短，但机制非常新颖有趣，未来潜力不小。比如有一种方式是将免疫防御受体（alloimmune defense receptor, ADR）工程化到T细胞上去。活化的淋巴细胞，包括T细胞与NK细胞表面，会高表达4-1BB（CD137），而当这些淋巴细胞不再活化时，4-1BB又再次下调，也就是4-1BB是区分活化/非活化淋巴细胞的重要标志物，而HAGV就是由活化的淋巴细胞攻击回输的异体细胞造成，所以说，如果能够除去这些活化的淋巴细胞，就能避免HAGV。所以这种流派的做法就是转进入CAR的同时，还转了一个ADR进去，当然，若想成功应用，TCR还是需要敲的。这个ADR说白了其实就类似一代的CAR，只不过把scFv部分换成了4-1BB的配体，也就是说ADR使得T细胞能直接靶向高表达4-1BB的活化T/NK细胞，进而杀死这些活化的T/NK细胞。此外还有亘喜的TruUCAR平台也是在做相似的事，他们设计的CAR具有双特异性。其中一种CAR是用于防御宿主免疫细胞的杀伤的，也就是靶向并杀死宿主的激活T细胞核NK细胞。另一种CAR则用来靶向并杀死肿瘤细胞。其实他们做的事，就是用回输T细胞本身进行“另一种清淋”，而不是用化疗药物来清淋。这么做的好处就是清淋效果持久，选择性更好（只杀死活化的淋巴细胞）。但也有风险存在，就是清淋效果太久，只要回输的T细胞不死，那么机体就要长期处于免疫抑制的状态，这或许为肿瘤患者会带来风险。

5 敲TCR，同时敲除部分HLA-1分子

在介绍这种流派之前，我们先来讲一下器官移植。在组织器官移植配型当中，供体与受体的配型是不需要完全一模一样的（否则世界上可能就没多少人能配型成功）。在HLA配型报告中，会重点关注HLA-A、HLA-B、HLA-DR三个基因座的6个位点，并且这6个位点尽量多配，但不强求。这是因为并非所有的HLA分子，都对免疫排斥反应同等重要。在诸多HLA-1类分子当中，其中HLA-A是对免疫排斥最重要的标志物，也就是说宿主与供体的HLA-A倘若错配，发生HVGR的风险极大，倘若宿主与供体的HLA-A相合，就只有很小的几率发生HVGR。说回这种UCAR-T的流派，就是利用了HLA-A的重要性。具体方式是敲除细胞TCR的同时，选择性敲除HLA-A，而非敲掉整个HLA-1类分子。这种方式的好处是，保留其余HLA-B和HLA-C，此时宿主的NK和T细胞不会杀伤回输的细胞。并且HLA-B和HLA-C的错配，反而能够改善肿瘤患者的复发情况和总生存期，是种一举两得的策略。

UCAR-T具有太多的优势，（1）健康供体效果更好。很多肿瘤患者在给与细胞疗法的时候，患者T细胞已暴露在多次放化疗、癌症的免疫效应或其他潜在自身免疫疾病中，自体的T细胞大都已发生耗竭。此时再从外周血中提T细胞予以改造，得到的“士兵”也往往战斗力不足。尤其是面临实体瘤这一巨大难关时，倘若自体的CAR-T细胞战斗力不足，则更加难以发挥作用。UCAR-T细胞取材自健康供体的T细胞，此时T细胞改造得到的“士兵”能力也更强，更能在实体瘤中发挥疗效；（2）现货供应及时治疗。自体CAR-T制备周期长达2-3周，延误病人获得治疗的时间，而UCAR-T作为现货型疗法，能够在第一时间给与患者用药；（3）价格便宜人人可用。自体CAR-T的昂贵价格，如果没有医保支持，很多患者会难以负担。倘若有一款优质的UCAR-T产品成功上市，其价格有可能会低于5万元人民币，这将使得细胞治疗的渗透率极大提升，惠及更多的患者；（4）批量生产稳定可控。不过UCART虽有千般好，但是想成功采摘这朵悬崖峭壁上的“天山雪莲”，还需完美跨过GvHD和HVGR两大难关。目前UCAR-T领域各种武功百花齐放，希望能尽早取得成功，真正改写细胞疗法的历史，真正造福全世界的广大患者。